О чем свидетельствует наличие агглютинации при определении индивидуальной совместимости крови

4. Пробы на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента

Проба на индивидуальную совместимость позволяет убедиться в том, что у реципиента нет антител, направленных против эритроцитов донора и таким образом предотвратить трансфузию эритроцитов, несовместимых с кровью больного.

Проба на совместимость, выполняемая на плоскости при комнатной температуре, имеет целью выявить у реципиента полные групповые агглютинины системы АВ0, MNSs, Lewis и др. Проба на совместимость с применением 10% желатина, 33% полиглюкина, непрямая проба Кумбса предназначена для выявления у реципиента неполных групповых антител. Двухэтапная проба в пробирках с антиглобулином предусматривает выявление и тех и других антител, в том числе групповых гемолизинов.

4.1. Двухэтапная проба в пробирках с антиглобулином

Первый этап. В маркированную пробирку вносят 2 объема (200 мкл) сыворотки реципиента и 1 объем (100 мкл) 2% взвеси трижды отмытых эритроцитов донора, суспендированных в физиологической растворе или LISS (раствор низкой ионной силы). Содержимое пробирки перемешивают и центрифугируют при 2500 об/мин (около 600g) в течение 30 с. Затем оценивают наличие гемолиза в надосадочной жидкости, после чего осадок эритроцитов ресуспендируют, слегка постукивая кончиком пальца по дну пробирки, и определяют наличие агглютинации эритроцитов. При отсутствии выраженного гемолиза и/или агглютинации переходят к выполнению второго этапа пробы с использованием антиглобулиновой сыворотки.

Второй этап. Пробирку помещают в термостат при температуре 37°С на 30 мин, после чего снова оценивают наличие гемолиза и/или агглютинации эритроцитов. Затем эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором, добавляют 2 объема (200 мкл) антиглобулиновой сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают. Пробирки центрифугируют в течение 30 с, осадок эритроцитов ресуспензируют и оценивают наличие агглютинации.

Учет результатов проводят невооруженным глазом или через лупу. Выраженный гемолиз и/или агглютинация эритроцитов указывает на присутствие в сыворотке реципиента групповых гемолизинов и/или агглютининов, направленных против эритроцитов донора, и свидетельствует о несовместимости крови реципиента и донора. Отсутствие гемолиза и/или агглютинации эритроцитов свидетельствует о совместимости крови реципиента и донора.

4.2. Проба на совместимость на плоскости при комнатной температуре

Учет результатов. Наличие агглютинации эритроцитов означает, что кровь донора несовместима с кровью реципиента и не должна быть ему перелита. Если по истечении 5 мин агглютинация эритроцитов отсутствует, то это означает, что кровь донора совместима с кровью реципиента по групповым агглютиногенам.

4.3. Непрямая проба Кумбса

В пробирку вносят одну каплю (0,02 мл) осадка трижды отмытых эритроцитов донора, для чего выдавливают из пипетки небольшую каплю эритроцитов и касаются ею дна пробирки, и добавляют 4 капли (0,2 мл) сыворотки реципиента. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, после чего их помещают на 45 мин в термостат при температуре +37°С. По истечении указанного времени эритроциты вновь трижды отмывают и готовят 5% взвесь в физиологическом растворе. Далее 1 каплю (0,05 мл) взвеси эритроцитов на фарфоровую пластинку, добавляют 1 каплю (0,05 мл) антиглобулиновой сыворотки и перемешивают стеклянной палочкой. Пластинку периодически покачивают в течение 5 мин.

Учет результатов проводят невооруженным глазом или через лупу. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о том, что кровь реципиента и донора несовместимы, отсутствие агглютинации является показателем совместимости крови донора и реципиента.

4.4. Проба на совместимость с применением 10% желатина

Результат учитывают, просматривая пробирки на свет невооруженным глазом или через лупу. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о том, что кровь реципиента и донора несовместимы, отсутствие агглютинации является показателем совместимости крови донора и реципиента.

4.5. Проба на совместимость с применением 33% полиглюкина

Источник

Алгоритм проведения гемотрансфузии

Правила клинического использования донорской крови и (или)ее компонентов.

Трудноопределимые группы крови

Неспецифическая агглютинация наблюдается при аутоиммунной гемолитической анемии и других аутоиммунных заболеваниях, сопровождающихся адсорбцией аутоантител на эритроцитах, при гемолитической болезни новорожденных, эритроциты которых нагружены аллоантителами матери.

Кровяные химеры. Кровяными химерами называют одновременное пребывание в кровяном русле двух популяций эритроцитов, отличающихся по группе крови и другим антигенам.

Трансфузионные химеры возникают в результате многократного переливания эритроцитной массы или взвеси группы 0 (I) реципиентам другой группы. Истинные химеры встречаются у гетерозиготных близнецов, а также после пересадки аллогенного костного мозга.

Другие особенности. Определение группы крови АВ0 и резус принадлежности может быть затруднено у больных в связи с изменением свойств эритроцитов при различных патологических состояниях (у больных циррозом печени, при ожогах, сепсисе).

Проба на совместимость на плоскости при комнатной температуре

для проведения проб на индивидуальную совместимось используется кровь ( сыворотка) больного, взятая перед трансфузией или не более чем за 24 часа, при условии хранения при температуре +4+2°С.

Проба на совместимость с применением 33%полиглюкина

В пробирку вносят 2 капли (0, 1 мл) сыворотки реципиента 1 каплю (0, 05) мл эритроцитов донора и добавляют 1 каплю (0, 1 мл) 33% полиглюкина.

Пробирку наклоняют до горизонтального положения, слегка потряхивая, затем медленно вращают таким образом, чтобы содержимое ее растеклось по стенкам тонким слоем. Контакт эритроцитов с сывороткой больного при вращении пробирки следует продолжать не менее 3 мин.

Результат учитывают, просматривая пробирки на свет невооруженным глазом или через лупу. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о том, что кровь реципиента и донора несовместимы, отсутствие агглютинации является показателем совместимости крови донора и реципиента.

Ошибочный порядок расположения реагентов.
Температурные условия (определение группы крови производят при температуре не ниже 15°Си не выше 25°С)
Соотношение реагентов и исследуемых эритроцитов.
Продолжительность наблюдения. (позволяет выявить слабый агглютиноген А_2, характеризующийся замедленной агглютинацией)

Биологическую пробу проводят независимо от объема гемотрансфузионной среды и скорости ее введения.

При необходимости переливания нескольких доз компонентов крови биологическую пробу проводят перед началом переливания каждой новой дозы.

в течение 3 мин наблюдают за реципиентом, контролируя у него пульс, дыхание, артериальное давление, общее состояние, цвет кожи, измеряют температуру тела

такую процедуру повторяют еще дважды. Появление в этот период даже одного из таких клинических симптомов, как озноб, боли в пояснице, чувство жара и стеснения в груди, головной боли, тошноты или рвоты, требует немедленного прекращения трансфузии и отказа от переливания данной трансфузионной среды.

Экстренность трансфузии компонентов крови не освобождает от выполнения биологической пробы.

Врач, проводящий переливание компонентов крови обязан:

1.Определить показания для проведения гемотрансфузионной терапии с учетом противопоказаний.

2. Получить информированное добровольное согласие реципиента или его законного представителя на проведение гемотрансфузионной терапии по установленной форме.

3. Провести первичное определение групповой принадлежности крови больного по системе АВО.

КАТЕГОРИЧЕСКИ ЗАПРЕЩАЕТСЯ ИСПОЛЬЗОВАТЬ ДАННЫЕ О ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ПО СИСТЕМАМ АВО И РЕЗУС ИЗ ПАСПОРТА, ПРЕДШЕДСТВУЮЩЕЙ ИСТОРИИ БОЛЕЗНИ И ДРУГИХ ДОКУМЕНТОВ.

4. Внести в направление в клинико-диагностическую лабораторию (форма № 207/у), сведения о результате определения группы крови по системе АВО, серии диагностикумов, трансфузионный и акушерско-гинекологический анамнез. Подписать направление

5. Ознакомиться с заключением клинико-диагностической лаборатории. Перенести данные о групповой и резус-принадлежности больного на лицевую часть медицинской карты стационарного больного с указанием даты анализа и своей фамилии.

6. Оформить предтрансфузионный эпикриз.

7. Провести макроскопическую оценку лабораторного желатина и диагностикумов.

8. Провести макроскопическую оценку каждой дозы гемотрансфузионной среды.

9. Повторно непосредственно перед трансфузией определить группу крови реципиента по системе АВО

10. Определить группу крови по системе АВО с эритроцитсодержащей средой.

11. Проконтролировать соответствие паспортных данных.

12. Провести пробу на совместимость крови реципиента и крови донора (гемотрансфузионной среды) по системам АВО и резус.

13. Зафиксировать результат изосерологических исследований в протоколе операции переливания крови.

ПРОБЫ НА ИНДИВИДУАЛЬНУЮ СОВМЕСТИМОСТЬ ПО СИСТЕМЕ АВО И РЕЗУС НЕ ЗАМЕНЯЮТ ДРУГ ДРУГА.

ПРОВОДЯТСЯ ВО ВСЕХ СЛУЧАЯХ С ОБРАЗЦАМИ КРОВИ ИЗ КАЖДОГО КОНТЕЙНЕРА.

ОБЯЗАТЕЛЬНЫ, ДАЖЕ ЕСЛИ ЭРИТРОЦИТНАЯ МАССА ИЛИ ВЗВЕСЬ ПОДОБРАНЫ РЕЦИПИЕНТУ ИНДИВИДУАЛЬНО В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОЙ ЛАБОРАТОРИИ.

14. Провести биологическую пробу. Зафиксировать её результат в протоколе операции переливания крови.

15. Контролировать состояние реципиента, темп введения трансфузионной среды.

16. При изменении состояния больного в первую очередь исключить посттрансфузионное осложнение.

17. Оценить показатели артериаль­ного давления, пульса, результаты термометрии.

18. Зарегистрировать гемотрансфузию:

•в дневнике наблюдений медицинской карты стационарного больного;

•в журнале регистрации переливаний крови и её компонентов (форма № 009/у) ;

•заполнить протокол гемотрансфузии

19. Провести макрооценку первой порции мочи.

20. Назначить клинические анализы крови и мочи на следующие сутки после гемотрансфузии.

21. Провести оценку суточного диуреза, водного баланса, результатов анализов мочи и крови.

22. Наблюдать за больным с отражением результатов наблюдения в дневнике истории болезни. При изменении клинической симптоматики и лабораторных показателей до выписки больного из стационара в первую очередь исключить посттрансфузионное осложнение.

Осложнения
-Иммунные осложнения ( острый гемолиз, гипертермическая негемолитическая реакция, анафилактический шок, некардиогенный отек легких)

-Неиммунные осложнения (острый гемолиз, бактериальный шок, ОССН, отек легких)

-Непосредственные осложнения (аллоиммунизация антигенами эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов или плазменными белками, гемолиз, реакция >, посттрансфузионная пурпура)

-Иммунные ( гемолиз, Реакция «трансплантат против хозяина», Посттрансфузионная пурпура, Аллоиммунизация антигенами эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов или плазменными белками

А. Г. Румянцев, В. А. Аграненко. Клиническая трансфузиология-М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1997.

Е. Б. Жибурт. Трансфузиология-С.: ПИТЕР, 2002.

Рагимов А. А. Трансфузиология. Национальное руководство-М.: ГЭОТАР Медиа, 2012.

Алгоритмы исследования антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител в сложнодиагностируемых случаях. Методические рекомендации N 99/181 (утв. Минздравом России 17. 05. 2000)

Приказ Минздрава России от 25. 11. 2002 N363 » Об утверждении Инструкции по применению компонентов крови»

Приказ Минздрава России от 02. 04. 2013 N183н » Об утверждении правил клинического использования донорской крови и (или) ее компонентов»

Источник

Определение группы крови

В 1901 году выдающийся ученый Карл Ландштейнер открыл группы крови и заложил основы современной трансфузиологии. Исследователь выявил три группы на основании различных вариантов реакции агглютинации эритроцитов и сывороток крови. Материал для исследования был взят у сотрудников собственной лаборатории. Ученики Ландштейнера Декастелло и Стюрли несколькими годами позже открыли четвертую группу, но посчитали ее сомнительной и исключили из результатов исследований. В 1906 году психиатр из Праги Ян Янский подтвердил существование группы AB (IV). Публикация исследования в местном издании оказалась практически незамеченной. В 1910 году после повторного обнаружения четвертой группы Моссом Ян Янский был вынужден доказывать первенство открытия. Чешский ученый предложил цифровое обозначение групп крови: I, II, III, IV.

В трансфузиологии группами крови называют различные сочетания антигенов эритроцитов. Антигены являются генетическими признаками: наследуются от родителей и остаются неизменными на протяжении жизни. В 1980 году Международное сообщество переливания крови разработало числовую терминологию для антигенов эритроцитов. Выделены 23 системы группы крови, включающие 194 антигена. Нумерация в большинстве случаев соответствует порядку обнаружения. Входящие в каждую из 23 систем антигены кодируются шестизначным номером: первые три цифры являются номером системы, оставшиеся три – указывают на специфичность антигена внутри системы.

Система группы крови AB0

Групповая принадлежность по системе AB0

По мере движения с запада на восток Евразии частота обнаружения антигена A падает, а антигена B возрастает. Антиген 0 редко встречается в Азии, но имеет широкое распространение у коренных народов Южной Америки, Полинезии и Австралии. Причина – эпидемии инфекционных заболеваний.

Результат типирования крови записывают в историю болезни или в карту донора. Врач-трансфузиолог указывает дату и ставит подпись.

В отдельных случаях во время типирования наблюдается слабовыраженная агглютинация эритроцитов. Недостаточно выраженная реакция объясняется наличием слабых вариантов антигенов A и B. Наибольшее клиническое значение представляют подгруппы A₁ и A₂. Впервые слабые варианты были обнаружены в 1911 году учеными Dungern и Hirszeld. Позднее в 1930 году Landsteiner и Levine предложили названия подгруппы – A₁ и A_2. A₂ встречается до 20 % в группе A и до 35 % в группе AB. Сыворотка лиц из образцов крови A₂ может содержать анти-A₁-антитела: в 2 % случаев в группе A₂ и в 30 % в A₂B. Антитела анти-A₁ представляют опасность ввиду агглютинации эритроцитов группы A.

Методика определения групп крови A₂ и A₂B

Частота выявления эритроцитов A₂ существенно варьируется в зависимости от применяемых реагентов. Приводим сравнение результатов исследования при использовании различных методик типирования групп крови A₂ и A₂B.

Примечание: * — агглютинация выражена слабо, присутствуют мелкие агглютинаты на розовом фоне.

Наибольшую точность исследования обеспечивает Анти-A₁ (лектин, фитогемагглютинин). Тест рекомендован для выявления подгрупп антигена A у детей младше двух лет. Причина – физиологическая незрелость эритроцитов новорожденных, влекущая ошибочные результаты исследования со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками.

В 1930 году Landsteiner и Levine обнаружили подтип Aint: промежуточный вариант между A₁ и A₂. Данный антиген характерен для негроидов и достигает 8,5 % у лиц с группой крови A. У европеоидов Aint наблюдался лишь у 1 % людей со второй группой крови. В крайне редких случаях у человека отсутствуют все антигены системы AB0. Фенотип «Бомбей» обусловлен генотипом hh. При отсутствии антигена H у лиц данной категории обнаруживаются анти-A и анти-B антитела.

Методика определения групп крови

Алгоритм выявления группы крови гемагглютинирующими сыворотоками

Для определения группы крови AB0 прямым методом используют две серии стандартных изогемагглютинирующих сывороток. Подготовьте две серии сывороток трех групп с титром 1:32 или выше. Для забора каждой сыворотки используйте отдельную маркированную пипетку. Подготовьте сыворотку AB(IV) для контроля.

В последнем случае следует удостовериться в отсутствии неспецифической реакции: нанесите на планшет 2 – 3 капли соответствующей группе AB(IV) сыворотки и добавьте одну каплю анализируемых эритроцитов. Перемешайте жидкости и оцените результат спустя пять минут. Отсутствие агглютинации свидетельствует о принадлежности к группе AB(IV), наличие – признак неспецифической реакции. В этом случае, а также при слабовыраженной агглютинации повторите исследование с другими сериями сывороток.

Техника определения группы крови цоликлонами

Моноклональные антитела к антигенам эритроцитов пришли на смену изогемагглютинирующих сывороток. Для каждого типирования достаточно одной серии реагентов анти-A, анти-B, анти-AB. Внедрение моноклональных реагентов позволило значительно упростить и стандартизировать методику типирования по системе AB0. Приводим краткое пошаговое руководство проведения исследования на планшете.

Обычно реакция обнаруживается уже в первые секунды после смешивания. При этом слабые варианты антигенов A и B могут давать более позднюю агглютинацию.

Непрямой метод типирования: алгоритм действий

Методика определения основана на взаимодействии эритроцитов от предварительно типированных лиц групп 0, A, B или смеси эритроцитов от нескольких одногруппных доноров с изогемагглютининами α и β в исследуемой сыворотке.

При работе с каждым типирующим реагентом используйте сухие чистые пипетки. Промывание палочек для перемешивания и пипеток осуществляйте в 0,9 % растворе NaCl.

Заключение о групповой принадлежности

Система Резус

Levine и Stetson обнаружили антигены системы Резус в 1939 году. Ученые изучали причины развития гемолитических реакций у рожениц при трансфузиях женщинам идентичных по системам AB0, MN и P. эритроцитов мужей. Годом позже Landsteiner и Wiener продуцировали выработку антител посредством иммунизации кроликов эритроцитами обезьян макака-резус. Антитела получили название анти-RH антитела. Полученные агглютинины вступали в реакцию агглютинации с эритроцитами макак-резус и с эритроцитами 85 % граждан Нью-Йорка белой расы. Вызвавший образование антител антиген получил название RH-фактор (D-фактор).

В редких случаях эритроциты людей не содержат ни одного антигена резус. Фенотип обозначают Rh_null. Ген Xr_o в этом случае представлен в гомозиготной форме и подавляет продуцирование всех антигенов. Обладатели фенотипа Rh_null не проявляют агглютиногеной активности, но имеют возможность передавать антигены по наследству.

Среди европейцев частота резус-положительных по антигену D лиц составляет 85 %. На мембране красных кровяных телец обычно расположено около 10 000 – 30 000 молекул D. При этом существуют два особых типа D-положительных лиц: D u (слабый) и D partial (частичный). Иммунная система D u и D partial способна вырабатывать анти-D-антитела.

Слабый антиген встречается у 1,5 % резус-положительных лиц и характеризуется низким числом (100 – 500) молекул D на мембране. Является иммуногенным для резус-отрицательных лиц. При этом переливание D-положительных эритроцитов больным со слабым D может вызвать сенсибилизацию кровяных телец донора. Эритроциты с D u слабо агглютинируются или совсем не вступают в прямую реакцию агглютинации с полными анти-резус антителами. Определение резус-принадлежности производят в непрямом антиглобулиновом тесте. Носителей D u считают резус-положительными донорами и резус-отрицательными реципиентами.

Антитела против антигенов резус являются иммунными. Возникают вследствие изосенсибилизации. Специфичность определяется спровоцировавшими образование антител антигенами. Выделяют полные и неполные антитела.

Полные являются IgM антителами. Отличаются большим молекулярным весом, обнаруживаются реже по сравнению с неполными антителами. Способны агглютинировать резус-положительные эритроциты. Имеют меньшее значение при трансфузиях.

Неполные преимущественно относятся к классу IgG. Закрепляются на поверхности резус-положительных эритроцитов без образования агглютинатов. Склеивание кровяных телец осуществляется при наличии коллоидных растворов и протеолитических ферментов или после обработки антиглобулиновой сывороткой. Обладают меньшим в сравнении с полными антителами молекулярным весом. Способны проходить через плаценту. Во время сенсибилизации сперва продуцируются полные антитела, далее в большей мере вырабатываются неполные (иммуноглобулины IgG) антитела.

Техника выявления резус-фактора с использованием цоликлона Анти-D-Супер

В случае наступления реакции кровь оценивается как резус-положительная (Rh+), при отсутствии реакции – как резус-отрицательная (Rh-). При отрицательной либо слабо выраженной агглютинации необходимо повторно провести исследование с неполными анти-D IgG антителами с целью выявления слабого или частичного антигена D.

Методика определения резус-фактора D u в пробирочном тесте

Параллельно с анализом выполняют постановку трех контрольных проб: реагента цоликлон Анти-D (анти-D IgG) со стандартными резус-положительными и резус-отрицательными эритроцитами, анализируемых эритроцитов с раствором желатина без диагностикума анти-D IgG.

Отсутствие результатов реакции с анти-D IgM и выраженная агглютинация с анти-D IgG свидетельствуют об обнаружении слабых форм антигена D. При слабо выраженной агглютинации следует повторить исследование в непрямой пробе Кумбса.

Определение резус-принадлежности стандартным универсальным реагентом

Стандартный реагент антирезус Rh₀D содержит поликлональные неполные анти-D-антитела. Параллельно с анализом образца осуществляется контрольное исследование реагента Rh₀D со стандартными резус-положительными (одногруппными или группы 0) и резус-отрицательными (одногруппными) эритроцитами.

Результат считается достоверным только после проверки контрольных образцов: наступлении реакции со стандартными резус-положительными и отсутствии реакции – с резус-отрицательными эритроцитами.

Информацию о пошаговой постановке непрямого теста Кумбса с использованием неполных анти-D-антител читайте в разделе сайта «Реакция Кумбса».

Источник