поле зрения микроскопа это
6.2. Микроскоп
Микроскоп предназначен для наблюдения мелких объектов с большим увеличением и с большей разрешающей способностью, чем дает лупа. Оптическая система микроскопа состоит из двух частей: объектива и окуляра. Объектив микроскопа образует действительное увеличенное обратное изображение предмета в передней фокальной плоскости окуляра. Окуляр действует как лупа и образует мнимое изображение на расстоянии наилучшего видения (рис. 6.4). По отношению ко всему микроскопу рассматриваемый предмет располагается в передней фокальной плоскости.
Рис. 6.4. Оптическая схема микроскопа.
6.2.1. Увеличение микроскопа
Действие микрообъектива характеризуют его линейным увеличением:
 , | (6.5) |
где 
– фокусное расстояние микрообъектива, 
– расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра, называемое оптическим интервалом или оптической длиной тубуса.
Изображение, создаваемое объективом микроскопа в передней фокальной плоскости окуляра рассматривается через окуляр, который действует как лупа с видимым увеличением:
 . | (6.6) |
Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра:
| (6.7) |
.Если известно фокусное расстояние всего микроскопа, то его видимое увеличение можно определить так же, как и у лупы:
 . | (6.8) |
Как правило, увеличение современных объективов микроскопов стандартизованное и составляет ряд чисел: 10, 20, 40, 60, 90, 100 крат. Увеличения окуляров тоже имеют вполне определенные значения, например 10, 20, 30 крат. Во всех современных микроскопах имеется комплект объективов и окуляров, которые специально рассчитываются и изготавливаются так, что подходят друг к другу, поэтому их можно комбинировать для получения разных увеличений.
6.2.2. Поле зрения микроскопа
Поле зрения микроскопа зависит от углового поля окуляра 
, в пределах которого получается изображение достаточно хорошего качества:
 . | (6.9) |
При данном угловом поле окуляра линейное поле микроскопа в пространстве предметов тем меньше, чем больше его видимое увеличение.
6.2.3. Диаметр выходного зрачка микроскопа
Диаметр выходного зрачка микроскопа вычисляется следующим образом:
 . | (6.10) |
где 
– передняя апертура микроскопа.
Диаметр выходного зрачка микроскопа обычно немного меньше диаметра зрачка глаза (0.5 – 1 мм).
При наблюдении в микроскоп зрачок глаза нужно совмещать с выходным зрачком микроскопа.
6.2.4. Разрешающая способность микроскопа
Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность. Согласно дифракционной теории Аббе, линейный предел разрешения микроскопа, то есть минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа:
 . | (6.11) |
Предельно достижимую разрешающую способность оптического микроскопа можно сосчитать, исходя из выражения для апертуры микроскопа (
). Если учесть, что максимально возможное значение синуса угла – единичное (
), то для средней длины волны 
можно вычислить разрешающую способность микроскопа: 
.
Из выражения (6.11) следует, что повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: либо увеличивая апертуру объектива, либо уменьшая длину волны света, освещающего препарат.
Иммерсия
Для того чтобы увеличить апертуру объектива, пространство между рассматриваемым предметом и объективом заполняется так называемой иммерсионной жидкостью – прозрачным веществом с показателем преломления больше единицы. В качестве такой жидкости используют воду (
), кедровое масло (
), раствор глицерина и другие вещества. Апертуры иммерсионных объективов большого увеличения достигают величины 
, тогда предельно достижимая разрешающая способность иммерсионного оптического микроскопа составит 
.
Применение ультрафиолетовых лучей
Для увеличения разрешающей способности микроскопа вторым способом применяются ультрафиолетовые лучи, длина волны которых меньше, чем у видимых лучей. При этом должна быть использована специальная оптика, прозрачная для ультрафиолетового света. Поскольку человеческий глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение, необходимо либо прибегнуть к средствам, преобразующим невидимое ультрафиолетовое изображение в видимое, либо фотографировать изображение в ультрафиолетовых лучах. При длине волны 
разрешающая способность микроскопа составит 
.
Кроме повышения разрешающей способности, у метода наблюдения в ультрафиолетовом свете есть и другие преимущества. Обычно живые объекты прозрачны в видимой области спектра, и поэтому перед наблюдением их предварительно окрашивают. Но некоторые объекты (нуклеиновые кислоты, белки) имеют избирательное поглощение в ультрафиолетовой области спектра, благодаря чему они могут быть «видимы» в ультрафиолетовом свете без окрашивания.
6.2.5. Полезное увеличение микроскопа
Глаз наблюдателя сможет воспринимать две точки как раздельные, если угловое расстояние между ними будет не меньше углового предела разрешения глаза. Для того чтобы глаз наблюдателя мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, необходимо иметь соответствующее видимое увеличение.
Полезное увеличение – это видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность микроскопа, то есть разрешающая способность микроскопа будет такая же, как и разрешающая способность глаза.
Если две точки в передней фокальной плоскости микроскопа расположены друг от друга на расстоянии 
, то угловое расстояние между изображениями этих точек 
. Из выражений (6.11) и (6.8) можно вывести видимое увеличение микроскопа:
 . | (6.12) |
Поскольку обычно диаметр выходного зрачка микроскопа около 0.5 – 1 мм, угловой предел разрешения глаза 2´ – 4´. Если взять среднюю длину волны в видимой области спектра (0.5 мкм), то для полезного увеличения микроскопа можно вывести зависимость:
 . | (6.13) |
Микроскоп с видимым увеличением меньше 500А не позволяет различать глазом все тонкости структуры предмета, которые изображаются как раздельные данным объективом (
). Использование видимого увеличения больше 1000А нецелесообразно, так как разрешающая способность объектива не позволяет полностью использовать разрешающую способность глаза (
).
6.4. Типы микроскопов
6.4.1. Световые микроскопы
Наиболее универсальными и потому наиболее распространенными являются биологические микроскопы (серии MULTISCOPE™, LABOROSCOPE™, INVERTOSCOPE™, производимые на ЛОМО). Современный биологический микроскоп имеет несколько сменных объективов и окуляров, а также фотоокуляры и проекционные окуляры, предназначенные для фотографирования изображения или его проецирования на экран. В таких микроскопах предоставляется возможность применять различные методы наблюдения (светлое поле, темное поле, метод фазового контраста).
Кроме микроскопов для биологических исследований, выпускаются и различные специализированные микроскопы.
Микроскопы сравнения обеспечивают визуальное сопоставление двух препаратов. Изображение каждого занимает половину поля зрения микроскопа, что позволяет проводить сравнительное изучение объектов.
Контактные микроскопы дают возможность проводить исследования микроскопических структур отдельных участков тканей, прижимая объектив к объекту исследования. LOMO производит серию микроскопов METAM™ для наблюдения, измерения, микрофотографии микроструктур металлов и других непрозрачных экземпляров.
Стереомикроскопы (серии SF™ и MX™) обеспечивают исследование объекта под разными углами зрения. При этом создается стереоскопический эффект, и наблюдаемое изображение воспринимается объемно.
Ультрафиолетовый и инфракрасный микроскопы предназначены для исследования объектов в ультрафиолетовом или инфракрасном участке светового спектра. Они снабжены флуоресцентным экраном, на котором формируется изображение исследуемого препарата, фотокамерой с чувствительным к этим излучениям фотоматериалом или электронно-оптическим преобразователем.
Поляризационный микроскоп (серия POLAM™) позволяет выявлять неоднородности (анизотропию) структуры при изучении строения тканей и образований в организме в поляризованном свете. Поляризационный микроскоп широко используют в медико-биологических исследованиях при изучении препаратов крови, шлифов зубов, костей и т.п.
Интерференционный микроскоп дает возможность исследовать объекты с низкими показателями преломления света и чрезвычайно малой толщины. В отличие от фазово-контрастного устройства, в интерференционном микроскопе луч света, входящий в микроскоп, раздваивается. Часть проходит через исследуемый объект, а другая – мимо. В окулярной части оба луча соединяются и интерферируют, что позволяет увидеть исследуемую структуру.
Принцип действия люминесцентного микроскопа (серия LUMAM™). основан на использовании люминесценции биологических объектов, возникающей под действием ультрафиолетового излучения. Наблюдая или фотографируя препараты в отраженном свете, можно судить о структуре исследуемого образца, что используется в микробиологии и в иммунологических исследованиях. Прямое окрашивание люминесцентными красителями позволяет выявлять такие структуры клеток, которые трудно рассмотреть в световом микроскопе.
Операционный микроскоп (серии MIKO™, MX™) используется для проведения микрохирургических операций в офтальмологии, нейрохирургии и других областях микрохирургии. Микроскоп имеет волоконнооптическую систему освещения операционного поля, демонстрационное визуальное устройство, фотоприставку; возможно подключение к нему киноаппаратуры для съемки операции и телевизионного наблюдения.
6.4.2. Электронные микроскопы
Электронный микроскоп построен на таком же принципе получения изображения, как и оптический, но вместо видимого света в нем используется пучок электронов.
Роль линз в электронном микроскопе играет совокупность электрических и магнитных полей. Поскольку электронные пучки не воспринимаются непосредственно глазом, в электронном микроскопе изображение либо фотографируется, либо проецируется на экран. Еще одно принципиальное отличие электронного микроскопа от оптического заключается в том, что в электронном микроскопе контраст создается за счет разного рассеяния электронов от соседних участков.
Длина волны электрона, как известно, во много раз меньше длины волны видимого света. Предел разрешения электронного микроскопа можно вычислить из выражения (6.11) при длине волны 0.005 нм. Даже при апертуре A=0.01 предел разрешения электронного микроскопа составит 
, что в 1000 раз меньше, чем в обычном оптическом микроскопе.
Однако, хотя предел разрешения электронного микроскопа несравнимо меньше, чем оптического, у электронного микроскопа есть свои недостатки, в частности, невозможность изучения живых биологических объектов, которые под воздействием пучка электронов мгновенно сгорят.
6.4.3. Сканирующие микроскопы
Сканирующие микроскопы основаны на другом принципе получения изображения, который позволяет преодолеть дифракционный предел разрешения. Принцип действия таких микроскопов основан на сканировании объекта сверхмалым зондом. Прошедший или отраженный сигнал регистрируется и используется для формирования трехмерной топографии поверхности образца с помощью ЭВМ.
Сканирующие микроскопы в зависимости от принципа взаимодействия зонда и образца разделяют на электронные, атомно-силовые и ближнепольные.
Наиболее интересен ближнепольный растровый сканирующий микроскоп (БРОМ), который работает в видимом излучении. Среди возможных механизмов формирования контраста в БРОМ можно отметить поглощение, поляризацию, отражение, люминесценцию и другие. Эти возможности отсутствуют в электронной и атомно-силовой микроскопии. Кроме того, световой микроскоп является сравнительно дешевым и неразрушающим инструментом исследования и позволяет работать с биологическими и медицинскими препаратами в естественных условиях.
Принцип действия ближнепольного растрового микроскопа заключается в сканировании объекта оптическим зондом на расстоянии меньше длины волны от объекта (в ближнем поле). Роль светового зонда в этом микроскопе выполняют светоизлучающие острия с выходными отверстиями, радиус которых в 10-20 раз меньше длины волны света.В результате ближнепольный растровый сканирующий микроскоп обеспечивает получение изображения с разрешением в десятки раз выше, чем в обычном микроскопе.
Компоненты микроскопа (часть 1)
В предыдущей главе мы провели обзор типов микроскопов и методов наблюдейния в микроскопии. Глава 2 посвящена компонентам микроскопа.
В отличие от лупы, микроскоп как правило имеет несколько ступеней увеличения. Функциональные и конcтруктивно-технологические части микроскопа предназначены для обеспечения работы микроскопа и получения устойчивого, максимально точного, увеличенного изображения объекта. Микроскоп включает в себя три основные функциональные части.
Осветительная часть предназначена для создания светового потока, который позволяет осветить объект таким образом, чтобы последующие части микроскопа предельно точно выполняли свои функции.
Осветительная часть включает источник света (лампа и электрический блок питания), и оптико-механическую систему (коллектор, конденсор, полевая и апертурная регулируемые ирисовые диафрагмы).
Воспроизводящая часть предназначена для воспроизведения объекта в плоскости изображения с требуемым для исследования качеством изображения и увеличения (т.е. для построения такого изображения, которое как можно точнее и во всех деталях воспроизводило бы объект с соответствующим для данной оптики микроскопа разрешением, увеличением, контрастом и цветопередачей).
Воспроизводящая часть включает объектив и промежуточную оптическую систему.
Визуализирующая часть предназначена для получения реального изображения объекта на сетчатке глаза, фотопленке или пластинке, на экране телевизионного или компьютерного монитора.
Визуализирующая часть включает монокулярную, бинокулярную или тринокулярную визуальную насадку с наблюдательной системой — окулярами, которые работают как лупа.
Объективы
Рассмотрим наиболее важные характеристики объектива, которые определяют: 1) кривизну, или плоскостность поля зрения (часть поля зрения, находящуюся в фокусе); 2) увеличение и разрешающую способность и 3) цвето-коррекцию.
Основные параметры объективов устанавливаются общепризнанным стандартом DIN (Deutsche Industrial Normen). Согласно этому стандарту устанавливается длина тубуса, равная 160 мм, высота объектива 45 мм (расстояние от плоскости предмета до опорного торца объектива), стандартные диаметры окуляров, резьба объективов, кодировка объективов в виде цветной полоски вокруг объектива (красной для увеличения 4Х, желтой — 10Х, белой — 100Х и т.д.).
Тубус — это расстояние от верхней линзы окуляра до плоскости зрачка объектива (примерно совпадающей с последней линзой объектива). Некоторые фирмы выпускают объективы на тубус «бесконечность», что означает, что изображение, даваемое объективом, образуется в бесконечности, а окуляр приводит это изображение в определенную плоскость. Объективы на тубус 160 мм (или 170 мм) включают в себя стандартные ахроматические объективы, при использовании которых в фокусе оказывается около 2/3 поля зрения; Полупланахромат объективы — 80 % поля зрения в фокусе и Планахромат объективы — 100% поля зрения в фокусе.
На биологических микроскопах MicroOptix MX100 установлены 4 полуплан ахромат объектива: 4x/0,10, 10x/0,25, 40x/0,65, 100x/1,25
Следует внимательно изучать документацию производителя: некоторые используют термин “flat field” для обозначения полуплоского, а “plan” — полностью плоского поля. Другие используют для этого же соответственно термины “achromatic” и “plan”. У одних производителей “microplan” обозначает полуплоское поле, у других — совершенно плоское. Поэтому внимательно читайте литературу.
Объектив одного стандартного DIN микроскопа можно установить на другой DIN микроскоп, при этом сохраняется парфокальность и центрировка (объяснение этих терминов приведено далее). Справедливо то, что объективы, рассчитанные на определенную длину тубуса, можно устанавливать на разные микроскопы «старого образца», правда при этом, как минимум, теряется парфокальность.
Цветокоррекция: По цветокоррекции (исправлению хроматической аберрации положения) объективы разделяются на ахроматические, полуапохроматические (флюоритовые) и апохроматические.
У ахроматических объективов исправлен хроматизм положения для двух длин волн — красных и синих лучей, т.е. фокус для этих лучей сводится в одну точку. Зеленые лучи имеют более короткий фокус. По этой причине контуры в изображении объекта имеют цветную кайму.
Самые часто используемые красители — гематоксилин и эозин (H&E), которые имеют соответственно красный и синий цвет. Не правда ли замечательно, что для окрашивания большинства ваших препаратов применяется H&E, а большинство ваших объективов — ахроматы?
Флюоритовые объективы используют флюоритовое стекло, которое сводит все области спектра ближе к одному фокусу. По исправлению хроматической аберрации положения эти объективы занимают промежуточное положение между ахроматами и апохроматами.
Апохроматические объективы полностью выравнивают фокус трех основных цветов и сводят все остальные области спектра практически к одинаковому фокусу.
Чем выше качество объектива, тем выше его цена, достигаемое увеличение и необходимость критической фокусировки из-за снижения глубины резкости.
Увеличение и разрешающая способность: С ахроматическими объективами можно работать с увеличением микроскопа до 1000х N.A. (N.A.или А — численная апертура объектива). Дальнейшее повышение увеличения не выявляет новые подробности в объекте и может привести только к ухудшению качества изображения. С флюоритовыми объективами можно работать без существенного ухудшения качества изображения до увеличения 1500А; с апохроматами — до 2000А.
Таким образом, при работе с апохроматом 100Х можно добиться увеличения 2000Х, получив ту же разрешающую способность, что и при работе с ахроматом 100Х при увеличении 1000Х. Вопрос к исследователю – стоит ли игра свеч?
Пример:
Ахроматический иммерсионный объектив 100Х с A=1,25 можно использовать для получения увеличения до 1250Х; флюоритовый объектив — до 1875Х и апохроматический — до 2500Х.
Снижение глубины резкости означает, что неопытный пользователь может пройти фокальную плоскость препарата, не заметив ее. Поверьте мне, апохроматические объективы настолько же сложны в применении, насколько высока их стоимость.
Общеизвестно, что чем лучше микроскоп, тем сложнее работать с ним. Для этого необходима более высокая квалификация пользователя.
Выше мы упомянули новый термин — численная апертура (N.A.) объектива. (Чаще в литературе численная апертура называется просто апертурой и обозначается буквой А; прим. редактора). Численная апертура объектива определяет разрешающую способность микроскопа, т.е. способность давать раздельное изображение двух соседних элементов препарата.
Для каждого препарата существует увеличение, при котором его видно лучше всего, и это, как правило, не самое высокое увеличение микроскопа. Однако при максимальном увеличении все три класса упомянутых выше объективов должны давать одинаковое разрешение. Чем меньше детали, которые вам нужно исследовать, тем лучше должен быть объектив, т.е.он должен обладать наивысшей разрешающей способностью.
Давайте представим себе самый мелкий объект, который можно исследовать (то есть увидеть его полностью и с хорошим разрешением). Сделаем не совсем верное, но полезное предположение, что длина волны света — 0,2 микрон. Один дюйм равен 25,4 мм, в каждом миллиметре 1000 микрон, так что мы говорим о 0,2 тысячной доли миллиметра; или 1/5 от 25400-ой доли дюйма. Поскольку длина волны света должна быть меньше, чем рассматриваемый объект (свет должен проходить от центра через все края), то можно считать, что самая мелкая деталь, которую можно исследовать под оптическим микроскопом, имеет размер 0,25 микрон. При этом микроскоп должен быть чистым, правильно настроенным и находиться в отличном рабочем состоянии.
Существует устройство, используемое для измерения при помощи микроскопа, точность которого, как утверждается, равна 1/8 микрона (0,125 микрон). (Мы обсудим его в разделе, посвященном измерению).
Защита фронтальной линзы объектива: Обычно объективы (чаще всего 100Х, реже 40Х и 20Х) выполняются в пружинящей оправе, предохраняющей повреждение фронтальной линзы объектива при давлении на предметное стекло. При неисправности этой оправы объектив может оказаться меньше своей оптимальной высоты и не достичь положения фокусировки. Точно также иммерсионное масло типа Б может препятствовать установке объектива на достаточно близкое расстояние до препарата до момента срабатывания пружинящей оправы.
Блокировка фокусировки: Чтобы предотвратить повреждение объектива, в некоторых микроскопах предусмотрено устройство блокировки, ограничивающее движение предметного столика вверх. Здесь проблема в том, что если при настройке использовалось толстое предметное стекло, то может оказаться, что потом настроить фокусировку при работе с тонким стеклом невозможно.
Одна фирма изготавливает микроскопы, которые обеспечивают фокусировку препарата перемещением по вертикали объективов вместо перемещения предметного столика; в этом случае объектив имеет ограничитель перемещения.
Длина тубуса: Большинство производителей изготовляют все объективы с расчетом на одну длину тубуса и для биологических микроскопов проходящего света, и для металлографических микроскопов падающего света. Однако некоторые фирмы выпускают объективы для тубусов длиной 160 мм, другие — объективы «на бесконечность» для специальных моделей. На одном и том же микроскопе их использовать невозможно. Одна фирма изготавливает объективы на тубус 160 мм для микроскопов проходящего света и на тубус 215 мм — для микроскопов отраженного света.
Окуляры
Первая характеристика окуляров — увеличение, указанное сверху или сбоку окуляра: 10x, 15x и т. п. Вторая характеристика — вынос выходного зрачка, то есть расстояние от последней поверхности окуляра до плоскости изображения, которое появляется в микроскопе. Это расстояние обычно составляет величину от 15 до 24 мм. Последнее расстояние необходимо для исследователей, которые вследствие астигматизма постоянно носят очки. Для остальных наблюдателей это расстояние колеблется от 15 до 18 мм.
Окуляры обладают увеличением, которое составляет часть общего увеличения микроскопа. Последнее же равно произведению увеличений окуляра и объектива. Таким образом, общее увеличение микроскопа при использовании 10-кратного объектива и 10-кратного окуляра равно 10 х 10 = 100x.
Бинокулярная насадка или другое оптическое устройство, введенное в оптический ход микроскопа, могут вносить дополнительное увеличение. Так, при использовании бинокулярной насадки с собственным увеличением 1,5x общее увеличение микроскопа в указанном выше примере будет равно 10 х 10 х 1,5 = 150x.
Обычно в окулярах имеется посадочное место для установки в них сеток для измерений или других целей. Это приводит к уменьшению внутреннего диаметра окуляра и к соответствующему уменьшению поля зрения. Заметим, что именно окуляр (а не объектив) определяет размер поля зрения микроскопа. Более подробно это будет рассмотрено при описании объективов. Есть много разных окуляров, предназначенных для различных целей.
В настоящее время используются редко, в основном на недорогих микроскопах с дешевыми объективами. Окуляр состоит из двух одиночных линз; вторая по ходу лучей — глазная линза — имеет небольшой диаметр и маленькую заднюю апертуру для ограничения поля зрения. Эти окуляры не обеспечивают цветокоррекцию, то есть компенсацию хроматических аберраций (см. раздел, посвященный поляризационным микроскопам).
Получили сегодня широкое распространение. Окуляры отличаются большим диаметром первой линзы, удобны в работе; выпускаются с различными расстояниями от оправы окуляра до плоскости, в которой образуется изображение. Наружный диаметр тубуса, куда вставляется такой окуляр, составляет 25 мм (около 1 дюйма). Внутренний диаметр тубуса равен обычно 23,5 мм; наружный диаметр окуляра — 23 мм; внутренний диаметр окуляра — 21,5 мм. В окуляр на специальный круглый выступ с внутренним диаметром 18 мм часто помещается сетка диаметром 20 мм. Таким образом, рабочая модель биологического микроскопа с 10x широкопольным окуляром обеспечивает поле зрения 18 мм, более совершенный микроскоп — 20 мм. Исследовательские микроскопы могут иметь поле зрения 20 или 25 мм, очень немногие микроскопы — 30 мм. Вероятно есть очень веские причины для использования такого широкого поля зрения, но автор не знает ни одной. Обычно интересующие исследователя структуры препарата перемещают в центр поля зрения при помощи предметного столика. Разумеется, бывают иные ситуации. Например, невропатолог предпочтет целиком рассматривать всю структуру нервной клетки Пуркинье и её ветвей или любую другую клетку. Но для этого он воспользуется объективом с низким увеличением, чтобы увеличить площадь препарата, находящуюся в поле зрения.
На всех биологических микроскопах MicroOptix установлены широкопольные окуляры 10x/18 мм
Востребованы не так часто. Раньше сложные объективы с высокими значениями числовой апертуры (см. дальше) давали различное увеличение для разных цветов — большее для фиолетового и синего и меньшее для красного. Из-за этого ближний конец поля изнутри светился синим, а дальний — красным. Для устранения такого эффекта устанавливали компенсационные окуляры, обеспечивающие противоположный эффект. Чтобы не возникало проблемы при работе с объективами низкого увеличения, их производят сразу со встроенной ошибкой, поэтому при использовании компенсационных окуляров цвета соответствовали действительности. Сложно, не так ли?
Окуляры с фокусированной верхней линзой. Предназначены для измерений при большом увеличении, позволяют настроить резкое изображение шкалы или сетки для всех пользователей. Однако для этого прекрасно подходят и обычные окуляры.
Продолжение темы «Компоненты микроскопа» через две недели. Расскажем о визуальных насадках, предметных столиках и конденсорах. Всего доброго.