Обработка эякулята что это
Почему так важна обработка спермы при использовании ее в программах ВРТ?
Хотя семенная плазма защищает сперматозоиды от неблагоприятных условий, таких как оксидантный стресс, она содержит факторы, ограничивающие оплодотворяющую способность сперматозоидов. Обработка спермы позволят быстро и эффективно удалить всё лишнее (лейкоциты, мертвые сперматозоиды) и сконцентрировать самые качественные и подвижные сперматозоиды в пробирке. В настоящее время применяют несколько методов подготовки спермы. Идеальный метод подготовки спермы оставляет жизнеспособные, подвижные сперматозоиды и обогащает качество и функции спермы, не нанося вреда. В нашей лаборатории ЭКО применяется метод центрифугирования эякулята в градиенте плотности с последующей его отмывкой в питательной среде.
«Естественный отбор» происходит так. Сперму откручивают в центрифуге через специальный градиент плотности, и центробежная сила прижимает все спермии ко дну пробирки. Затем производят отмывку осадка. Через 30-40 минут самые активные из них поднимаются со дна пробирки, а малоподвижные и неподвижные остаются в осадке. При помощи пипетки эмбриолог отбирает несколько миллионов наиболее активных спермиев и помещает их в чашку с яйцеклетками. С этого момента и начинается процедура оплодотворения.
Сайт использует cookie-файлы и другие аналогичные технологии. Если, прочитав это сообщение, вы останитесь на сайте, это означает, что вы не против использования этих технологий. Подробнее
Обработка эякулята что это
Сперма или эякулят – это порция сперматозоидов и спермоплазмы, выделяющаяся из уретры во время одной эякуляции. При селекции половых клеток с целью дальнейшего их использования в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), либо при проведении научных и лабораторных исследований бывает необходимо выделение половых клеток из спермоплазмы.
Для выделения сперматозоидов из спермы существуют разные методы: отмывание от семенной плазмы, центрифугирование эякулята в градиенте плотности и метод «swim-up». Другие методы обработки спермы, например, методы фильтрации (в колонках из стекловолокна, стеклянных гранул или поперечно-сшитого декстранового геля), используются крайне редко в силу их неоправданной трудоёмкости.
Важным условием при выборе того или иного метода является сохранение жизнеспособности и кинетических параметров мужских половых клеток после их выделения, а при выделении сперматозоидов с целью их селекции для программ ВРТ необходимым является получение фракции прогрессивно подвижных форм сперматозоидов с нормальной структурой хроматина [1, 10].
Достаточно часто применяется метод отмывания, в результате которого сперму разделяют на сперматозоиды и спермоплазму центрифугированием при 1700 g, после сперматозоиды отмывают дважды физиологическим раствором, или после разведения спермы в 0,9 % NaCI (1:1) отмывание выполняют центрифугированием при 400 g в течение 5 мин [5, 7].
Метод отмывания – самый простой метод выделения сперматозоидов из спермы и в процессе подготовки сперматозоидов к программам ВРТ применяется чаще всего к эякуляту хорошего качества. К недостаткам метода относят образование активных форм кислорода (АФК) в осадке клеток после центрифугирования, а так же оседание вместе с подвижными сперматозоидами потенциально токсичных клеток и мёртвых сперматозоидов, что может оказывать негативный эффект и сказываться на сохранности генетического материала жизнеспособных сперматозоидов [6, 8].
Поэтому одним из направлений оптимизации программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) является разработка методов, позволяющих с наибольшей эффективностью выделить из спермы фракцию прогрессивно подвижных сперматозоидов, используемую для инсеминации ооцитов, которая имела бы наилучшие показатели кинематики и морфологии. В связи с этим наиболее широко применяемыми в ВРТ и в большинстве лабораторий для получения подвижной фракции используется метод всплытия «swim-up», либо фракционирование эякулята в градиенте плотности перколла (технология обработки спермы «Percoll» или «PureSperm») [1, 9].
Метод всплытия «swim-up» довольно часто используемый метод миграции сперматозоидов. Подход имитирует естественное перемещение сперматозоидов через цервикальную слизь. При этом фракция спермы располагается под фракцией культуральной среды, что позволяет прогрессивно подвижным сперматозоидам переместиться во фракцию среды. В качестве среды часто используется среда ReadySwimtm («Nidacon International AB», Швеция).
Метод «swim-up» отделяет сперматозоиды от остального состава эякулята исключительно на основании их подвижности, однако не отделяет ни морфологически деформированные, ни сперматозоиды с нарушенным хроматином. Так же не удаляются бактерии и вирусы, присутствие которых и продуцируемых ими эндотоксинов или реакционноактивных соединений кислорода из клеток, мёртвых или погибающих сперматозоидов, оказывает губительное действие на функциональную полноценность хроматина, на оплодотворяющую способность и выживаемость всех сперматозоидов [4, 10].
Центрифугирование спермы в градиенте плотности позволяет отобрать подвижные сперматозоиды с нормальной морфологией. Метод основан на принципе центрифугирования спермы через градиент, образованный, двумя-тремя слоями растворов с возрастающей плотностью (масса/объём), содержащих различные концентрации частиц коллоидного кремния. Таким образом, подход основан на разделении компонентов (клеток) эякулята по их удельному весу и плотности.
При выполнении метода градиентного центрифугирования образец спермы располагается поверх градиента. В процессе центрифугирования сперматозоиды перемещаются к той позиции в градиенте, которая отвечает их собственной плотности, другими словами, к их изопикнической точке [9].
Технология центрифугирования сперматозоидов в градиенте плотности возможна с использованием в качестве коллоида «Percolltm» («KABI Pharmacia», Швеция) для исследовательских целей, а для клинического использования в качестве материала для выделения сперматозоидов из спермы применяется «PureSperm» («Nidacon International AB», Швеция).
Кроме того, в процессе градиентного центрифугирования могут быть отделены другие клетки, присутствующие в сперме, например, лейкоциты и эпителиальные клетки, так же как мёртвые и погибающие сперматозоиды, которые служат источником АФК и могут вызывать оксидативный стресс. Одновременное удаление сперматозоидов с повреждённым хроматином и источников АФК должно смягчить воздействие их высокой концентрации на образцы спермы в процессе её обработки [2, 3].
Считается, что применение перколла позволяет более полно выделить из спермы прогрессивно подвижные сперматозоиды. В то же время популяция сперматозоидов, полученная при использовании метода «swim-up», характеризуется лучшими кинематическими параметрами, а также меньшим числом нежизнеспособных и апоптотических сперматозоидов по сравнению с популяцией клеток, выделенных методами простого отмывания от семенной плазмы и непрерывного центрифугирования в градиенте плотности перколла [1].
Относительно того, какой из методов выделения фракции подвижных клеток в большей степени повышает долю морфологически нормальных сперматозоидов, нет единого мнения. Имеются указания как на преимущества использования перколла, так и «swim-up», а также равную эффективность этих методов.
Сравнительный анализ этих двух основных методов выделения прогрессивно подвижной фракции сперматозоидов показал, что метод «swim-up» более эффективен в селекции клеток с нормальным хроматином, чем градиент плотности. Более того, после обработки в градиенте «PureSperm» в некоторых случаях степень повреждения ДНК – индекс фрагментации (ИФ) – повышался. Средний ИФ в эякуляте составлял 12 %, после применения «swim-up» – 5,5 % [1].
Некоторые авторы считают, что наиболее эффективным для выделения из спермы фракции прогрессивно подвижных сперматозоидов и при селекции клеток с нормальной структурой хроматина, является комбинированный метод, суть которого заключается в последовательном применении центрифугирования в изотоническом 90 % перколле и дальнейшего всплытия сперматозоидов из полученного осадка. Эта модификация позволяет сочетать преимущества обеих методик. Так, было показано, что при этом эффективно повышается доля сперматозоидов с нормальной структурой хроматина. Применение комбинированного метода выделения прогрессивно подвижных половых клеток позволяет получить популяцию сперматозоидов со значительно лучшими морфологическими характеристиками по сравнению с нативным эякулятом как при нормо-, так и при патоспермии [9, 10].
Следует так же отметить, что немаловажным при выделении сперматозоидов из спермы для селекции клеток с целью дальнейшего их использования в программах ВРТ является контроль контаминации.
Способность градиента PureSperm удалять вирусы, например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) или вирус гепатита С, имеет важное значение для предложения ВРТ супружеским парам, в которых муж инфицирован.
Применение градиента PureSperm в сочетании с методом «swim-up» при выделении сперматозоидов для ВРТ способно снижать вирусную контаминацию ниже уровня детекции и является безопасной альтернативой для зачатия ребенка у супружеских пар, в которых муж серопозитивен по ВИЧ.
В то же время отделение всех вирусов от популяции сперматозоидов может быть невозможным. Так, например, удалось идентифицировать ДНК вируса папилломы человека в сперматозоидах после обработки в градиенте перколла, т.е. сперматозоиды могут служить в качестве векторов для определенных вирусов. Однако некоторые авторы считают, что вирус папилломы человека может удаляться градиентом плотности PureSperm [1].
Анализируя данные разных исследований, проведённых как в России, так и за рубежом, можно сказать, что до настоящего времени не сложилось единого мнения какой метод лучше использовать для выделения сперматозоидов из нативного эякулята. Выбор метода зависит от того, проводится выделение половых клеток для исследовательских целей или для клинического использования, а так же от характеристик эякулята и правил, предусмотренных в конкретной лаборатории. Так, например, к недостатку методики «swim-up» следует отнести неадекватность подхода при выраженной астенозооспермии (низкой подвижности сперматозоидов). Подход градиентного центрифугирования применяется многими лабораториями, как штатный способ обработки спермы низкого качества.
Причины мужского бесплодия
Половая система мужчины включает наружные и внутренние органы. К внешним органам относятся мошонка и пенис, к внутренним – яички, их придатки, семяпроводы, простата, семенные пузырьки.
Наружные органы
Член – внешний орган, который служит для осуществления сексуального контакта, доставки семенной жидкости внутрь влагалища женщины, мочевыведения из мочевого пузыря.
Мошонка – это мышечно-кожный орган, внутри которого находятся яички, их придатки и первичный отдел семенного канатика, разделенного перегородкой, которая задает форму и соответствует эмбриональному шву. Шов может не различаться или напротив – быть выделенным. Положение и вид шва не оказывает никакого влияния на здоровье.
Внутренние органы
Яички – парная половая железа, основная функция которой – это выработка тестостерона и семенной жидкости. Тестикулы (синоним) находятся в мошонке и как правило, на разном уровне (часто левое яичко немного ниже правого), совершенно нормально и то, что они могут различаться по своему размеру.
Семявыводящие пути – протоки, по которым эякулят выходит из яичной полости после выработки. Семяпроводы продолжают канал придатка яичка, они ведут сквозь паховый канал, далее соединяются друг с другом и образуют один проток, выбрасывающий семя. Продвижение эякулята по семяпроводам реализуется за счет их волнообразного движения и сокращений. В момент достижения оргазма семенная жидкость поступает по семявыводящим путям в уретру, а из нее во влагалище или вовне.
Семенные канатики – это парные анатомические органы, которые тянутся от яичного придатка до места соединения с протоками семенного пузырька. Главные функции семенного канатика – направление спермы от придатка до семяпровода, а также кровоснабжение яичка.
Простата – вырабатывает секрецию, которая входит в состав эякулята. Предстательная железа (синоним) находится между мочевым пузырем и прямой кишкой, через нее идет канал уретры. Так называемый простатический сок выводится из простаты посредством сокращения гладких мышц железы. Особенно интенсивное выделение секреции происходит во время эякуляции.
Секреция – белая, полупрозрачная жидкость, которая играет роль разбавления спермы, а также является активатором для движения сперматозоидов.
Семенные пузырьки – это парные, специфические жилистые образования, которые вырабатывают специальный секрет, который входит в состав семени и представляющий собой вязкую белковую жидкость с повышенным содержанием фруктозы. Состав секреции сбалансирован и рассчитан таким образом, чтобы он придавал сопротивляемость внешним факторам и энергию сперматозоидам.
Эякулят – смесь вырабатывающихся в процессе яэкуляции специальных продуктов секреции. Состав спермы (синоним) можно разделить на две части: семенную плазму (представлена секрецией предстательной железы, выделениями яичек, придатков яичек, семенными протоками) и форменные элементы (первичные половые клетки яичек, сперматозоиды).
Эякулят взрослого мужчины представлен в виде вязко-липкой слизеподобной, неоднородной, непрозрачной жидкости.
Количество вырабатываемой семенной жидкости определяется состоянием здоровья, количеством выпитой жидкости, возрастом, частотой половых актов и т.д. Чем чаще совершается сексуальный контакт, тем меньше будет объем спермы при следующей эякуляции.
Норма оплодотворяющей способности семени – количественное соотношение 60-120 миллионов сперматозоидов на 1 мл эякулята. Возможность к воспроизводству потомства напрямую зависит от ее качества и количества. За секунду в здоровом организме мужчины производится около тысячи спермиев. Этот процесс активируется при половом созревании и длится до конца жизни. Однако есть множество причин, которые могут вывести эту систему из строя.
Мужское бесплодие бывает первичным (1) и вторичным (2).
В первом случае факт зачатия не был зафиксирован.
Наступление беременности указано в анамнезе, но по каким-то приобретенным причинам повторить это не удается.
В основе бесплодия мужчины несколько типичных проблем:
Резкое снижение числа качественных сперматозоидов;
Неполноценность, дефекты развития сперматозоидов (низкие показатели жизнеспособности, активности и пр);
Нарушения движения сперматозоидов по семявыводящим путям или проблемы при выбросе наружу.
Причины, которые могут спровоцировать развитие мужского бесплодия (вторичного или первичного):
Врожденные генетические нарушения и дефекты;
Варикоцеле – увеличение вен семенного канатика и яичка. В результате прогрессии заболевания значительно повышается температура яичек, из-за чего происходит сбой в их функционирования.
Травмы и дефекты половых органов.
Перенесенные инфекционные заболевания (гонорея, хламидиоз, сифилис, трихомониаз и пр), но не хуже ЗППП на половую деятельность мужчины может повлиять свинка, перенесенная в детстве.
Воспалительные процессы органов мочеполовой системы.
Иммунологические нарушения: выработка веществ, которые повреждают сперматозоиды (часто про сбое работы иммунной системы).
Гормональные нарушения (дефицит тестостерона).
Определить и диагностировать бесплодие самостоятельно – невозможно, поэтому за конечным заключением нужно обращаться к узкопрофильному специалисту.
Бесплодие – это болезнь, и в случае бесплодия необходимо выявить причину болезни и как можно раньше приступить к ее лечению.
Приготовление человеческих сперматозоидов в программах ВРТ.
Образец семени (эякулят) состоит из семенной жидкости (плазмы), сперматозоидов, иммунных и эпителиальных клеток, клеточного дебриса и бактерий. Вирусное обсеменение тоже может иметь место. Каждый из этих компонентов оказывает значительное влияние на выживаемость сперматозоидов (табл. 1), иногда даже до такой степени, что может происходить полная потеря их оплодотворяющей способности после 30-минутного пребывания в семенной плазме.
In vivo подвижные сперматозоиды быстро мигрируют из разжижающегося эякулята в шейку матки, в процессе чего освобождают себя от остатков семенной плазмы и реакционногенных соединений кислорода, возникающих из клеточного дебриса, и погибающих сперматозоидов. Через шейку матки сперматозоиды быстро распространяются по всему женскому репродуктивному тракту и достигают отдел, где происходит оплодотворение. В андрологической лаборатории этот процесс отделения подвижных сперматозоидов от остатков эякулята может имитироваться использованием как метода swim-up, так и метода центрифугирования в градиенте плотности. Эти две технологии являются наиболее широко применяемыми в ВРТ [39]. Иногда необходимо эксплуатировать оба этих метода, например, при обработке контаминированных вирусами эякулятов (см. ниже).
Таблица 1. Компоненты семенной плазмы и их влияние на жизнеспособность сперматозоидов
Хотя технология центрифугирования сперматозоидов в градиенте плотности была впервые разработана в 1996 г. с использованием Percoll tm («KABI Pharmacia», Швеция) в качестве коллоида [6], его применение было ограничено производителем только для исследовательских целей. Поэтому клиники ЭКО должны быть осведомлены, что Percoll tm не лицензирован для клинического использования. С тех пор, как имеются в наличии лицензированные материалы, такие как PureSperm («Nidacon International AB», Швеция), клиники могут столкнуться с риском судебного преследования, если они продолжают применять нелицензированные продукты [28].
Помимо лицензирования для клинического использования, PureSperm обладает несколькими преимуществами перед Percoll tm как материал для приготовления спермы методом центрифугирования в градиенте плотности. Если Percoll tm состоит из частиц двуокиси кремния, связанных с поливинилпиролидоном (ПВП) в воде, и к нему необходимо добавлять специальный солевой раствор перед использованием, PureSperm содержит силансвязанные частицы двуокиси кремния в HEPES-забуференном сбалансированном растворе солей, который поддерживает жизнеспособность сперматозоидов во время центрифугирования. Более того, присутствие HEPES в качестве буфера оказывает антиоксидантное действие. PureSperm стерилизуется в процессе производства автоклавированием и имеет сверхнизкий уровень эндотоксинов; Percoll tm не может быть автоклавирован и имеет значительные колебания в содержании эндотоксинов от партии к партии, что приводит к невозможности использования некоторых партий для обработки сперматозоидов.
Присутствие ПВП в Percoll tm является основанием для беспокойства. Как докладывалось, ПВП служит причиной субмикроскопических изменений [37], его использование для замедления движения сперматозоидов перед процедурой ИКСИ вызывает несвоевременную деконденсацию спермального хроматина [10] и снижение процента оплодотворения [17]. Некоторые клиники вообще избегают применять ПВП [13] и сообщают в результате о повышении оплодотворяемости ооцитов и улучшении качества эмбрионов [25].
Центрифугирование в градиенте плотностис использованием PureSperm
PureSperm состоит из коллоидного раствора двуокиси кремния в сбалансированном, забуференном HEPES растворе солей. Производителем рекомендуется двухслойный градиент, включающий 40 и 80% PureSperm. Градиент может создаваться за счет разбавления PureSperm буфером PureSperm Buffer или использованием готовых к употреблению PureSperm 40 и PureSperm 80. Эякулят осторожно, не нарушая разделение слоев, наслаивается на градиент, так как его повреждение снижает эффективность сепарации. Протокол использования PureSperm изображен на схеме 1.
Градиент центрифугируется при 300 g в течение 20 мин, после чего осадок из наиболее подвижной фракции сперматозоидов легко заметен на дне конической центрифужной пробирки. Следующий этап заключается в осторожном удалении пастеровской пипеткой эякулята, а также верхнего и большей части нижнего слоев градиента, после чего осадок отбирается новой стерильной пастеровской пипеткой. Центрифугат затем переносится в новую центрифужную пробирку для отмывания остатков коллоидного раствора.
Существенно важно отделить спермальный осадок вышеописанным способом и перенести в чистую центрифужную пробирку. Использование для отмывания осадка той же центрифужной пробирки, что применялась для создания градиента, приводит к загрязнению суспензии сперматозоидов бактериями и другими компонентами семенной жидкости. Если градиент плотности был выполнен правильно, согласно вышеизложенной инструкции, осадок должен содержать только функционально активные подвижные сперматозоиды. Они могут быть использованы для внутриматочной инсеминации, экстракорпорального оплодотворения или метода ИКСИ.
Среда для метода swim-up ReadySwim tm («Nidacon International AB», Швеция) наслаивается на аликвоту уже разжиженного эякулята в центрифужной пробирке (схема 2), которая затем ставится в термостат под углом примерно в 45°. После инкубирования в течение 1 ч при 37 °С отбирается около 1 мл суспензии и центрифугируется до образования осадка из сперматозоидов, которые затем ресуспендируются в подходящей среде для использования при внутриматочной инсеминации, ЭКО или ИКСИ.
Схема 1. Обработка спермы методом центрифугирования в градиенте плотности PureSperm.
Замечание: рекомендуется для обработки каждого эякулята готовить два градиента.
Схема 2. Проведение метода swim-up с использованием ReadySwim.
Сравнение двух методов для приготовления сперматозоидов
По сути, метод swim-up отделяет сперматозоиды от остального состава эякулята исключительно на основании их подвижности. Поэтому малоподвижные сперматозоиды могут попадать в среду вместе с активно подвижными, как и сперматозоиды с морфологическими дефектами и поврежденной ДНК. Даже бактерии и вирусы могут преодолевать барьер между эякулятом и средой. Выявлено высокое содержание бактерий в готовой взвеси сперматозоидов, полученной при использовании среды без антибиотиков [20]. Более того, возможно загрязнение реактогенными соединениями кислорода. Содержание большого количества таких соединений приводит к нарушению оплодотворяющей способности спермы [3].
Напротив, центрифугирование в градиенте плотности фракционирует клеточные популяции в соответствии с их плотностью и подвижностью. В процессе центрифугирования сперматозоиды перемещаются к той позиции в градиенте, которая отвечает их собственной плотности, другими словами, к их изопикнической точке [27]. Поэтому сперматозоиды с неповрежденной ДНК находятся в прямой зависимости от доли сперматозоидов с интактной ДНК [38].
Таблица 2. Сравнение методов обработки спермы: центрифугирование в градиенте плотности и swim-up
Посторонние клетки, например, лейкоциты и эпителиальные клетки, так же как мертвые и погибающие сперматозоиды, служат источником реакционногенных видов кислорода. В маленьком количестве они необходимы сперматозоидам для модулирования генной и белоксинтезирующей активности в процессе собственной дифференцировки и функционирования. Однако когда содержание реакционногенных видов кислорода превышает норму, происходит необратимое повреждение спермального хроматина, которое ведет к нарушению фертилизационного потенциала и некрозу спермиев (Aitken & Clarkson, 1988). Отрицательное воздействие реакционногенного кислорода на функциональную полноценность хроматина было задокументировано и подробно описано в работах [12]. Одновременное удаление сперматозоидов с поврежденным хроматином и источников реакционногенных видов кислорода должно смягчить воздействие их высокой концентрации на образцы спермы в процессе ее обработки.
Наличие бактерий в эякуляте может оказывать прямое влияние на оплодотворяющую способность при их адгезии на поверхности сперматозоидов [9, 14, 40], что приводит к снижению подвижности последних [19] и преждевременному индуцированию акросомной реакции [11]. Более того, бактериальная микрофлора может проявлять непрямое воздействие, продуцируя эндотоксины. Бактерии в приготовленных образцах спермы могут контаминировать среду, используемую в программах ЭКО для культивирования эмбрионов. Установлено, что Ureaplasma urealyticum повреждает нуклеарный хроматин в сперматозоидах человека и крысы. Несмотря на высокий процент оплодотворения ооцитов в культурах, инфицированных этим микроорганизмом, эмбрионы неспособны в них развиваться до стадии бластоцисты.
Возможность контролировать бактериальную контаминацию в обработанных образцах спермы без использования антибиотиков представляется очень важным с точки зрения защиты гамет от повреждения и предупреждения аллергических реакций у пациентов и медицинского персонала [27]. Не исключено, что такие антибиотики, как гентамицин, окситетрациклин, хлортетрациклин, неомицин, канамицин, нистатин, амфотерицин В, колимицин и хлорамфеникол, являются токсичными для спермы [35]. Хотя сочетание пенициллина и стрептомицина может быть использовано в средах для сперматозоидов, слебудут осаждаться во время центрифугирования, тогда как сперматозоиды с нарушенным хроматином, обладающие меньшей плотностью, будут задерживаться в верхнем слое или на границе раздела сред градиента. Подобным образом изопикническая точка для сперматозоидов с морфологическими дефектами головки будет находиться на другом уровне из-за их отличающейся плотности, на котором они и будут концентрироваться [32].
Основные различия качества образцов спермы после обработки методами swim-up и градиентного центрифугирования представлены в табл. 2. В отличие от swim-up в процессе градиентного центрифугирования удаляются аномальные сперматозоиды, посторонние клетки и бактерии. Сперматозоиды с дефектами морфологии бывают способны осуществлять оплодотворение, однако дальнейшее развитие таких эмбрионов и развитие беременности могут быть нарушены. В нескольких публикациях утверждается взаимосвязь морфологии сперматозоидов и процента оплодотворения. Заключают [32], что использование метода центрифугирования в градиенте плотности для приготовления образцов спермы помогает улучшить результативность программ ВРТ за счет повышения оплодотворяемости ооцитов.
Сперматозоиды с дефектами хроматина конкурируют с нормальными спермиями в процессе оплодотворения, поэтому во избежание получения эмбрионов низкого качества очень важно не допустить их попадание в суспензию, предназначенную для ЭКО [4]. Процент эмбрионов, прошедших дробление in vitro (Filatov et al., 1999), и процент достигнутых беременностей в ВРТ дует отметить, что дробление эмбрионов происходит быстрее при их отсутствии. Более того, пенициллин G разрушается в культуральной среде на 50% в течение 24 ч при 37° С [29]. Таким образом, предпочтительнее использовать такую технологию приготовления спермы для удаления бактериальной микрофлоры, которая позволяет избежать добавление антибиотиков в среду для отмывки сперматозоидов.
Способность градиента PureSperm удалять вирусы, такие как, например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), имеет решающее значение для предложения ВРТ супружеским парам, в которых муж серопозитивен по ВИЧ. В некоторых странах, например в Швеции, не разрешено применение спермы мужчин, зараженных ВИЧ, в программах ВРТ. Однако было показано в нескольких клиниках, расположенных в разных странах, что вирусная контаминация снижается ниже уровня детекции при приготовлении сперматозоидов с помощью градиента PureSperm в сочетании с методом swim-up [15, 23, 24, 31].
Следует отметить, что по всему миру были рождены более чем 1000 детей в разных программах ВРТ с применением метода градиентного центрифугирования образцов спермы от инфицированных доноров [22]. Таким образом, использование сочетанного протокола градиентного разделения и swim-up является намного более безопасной альтернативой для зачатия ребенка у супружеских пар, в которых муж заражен ВИЧ, чем продолжение ведения половой жизни.
Результаты недавно проведенных исследований во Франции позволяют предполагать, что при использовании градиента PureSperm могутудаляться и другие патогенные вирусы, например, вирус гепатита С [7, 22, 31]. В то же время отделение всех вирусов от популяции сперматозоидов может быть невозможным, недавно сообщалось об идентифицировании с помощью полимеразной цепной реакции ДНК вируса папилломы человека в сперматозоидах после обработки в градиенте Перколли [8]. Авторы заключают, что сперматозоиды могут служить в качестве векторов для определенных вирусов. Напротив, [5] докладывает, что источником вируса папилломы человека могли быть слущивающиеся с эрозий клетки канала уретры; такие клетки, а значит и вирусная контаминация, могут удаляться градиентом плотности PureSperm. Поэтому необходимы дополнительные исследования для ответа на вопрос, могут ли частицы этого вируса успешно удаляться при центрифугировании в градиенте.
Использование центрифугирования в градиенте плотности (PureSperm) в качестве метода для обработки спермы представляет эффективную технологию для отбора нормальных, функционально активных сперматозоидов из эякулята. Применение градиента обеспечивает выделение сперматозоидов из эякулята, контаминированного различными патогенами, и делает возможным использование программ ВРТ для пациентов, зараженных инфекциями, передаваемыми половым путем. Эффективный отбор функционально активных сперматозоидов в процессе градиентного центрифугирования для осуществления оплодотворения приводит к улучшению результатов в программах ВРТ.
Дж.М. Моррелл, П.В. Холмз
Nidacon International AB, Швеция
1. Agarwal A., Ranganathan P. Higher rates of recovery with PureSperm density gradient compared to ISolate. Hum Reprod 2001; 16: P-053.
2. Aitken R.J., Clarkson J.S., Fishel S. Generation of reactive oxygen species, lipid peroxidation, and sperm function. Biol Reprod 1989a; 41: 183.
3. Aitken R.J., Clarkson J.S., Hargreave T.B., Irvine D.S., Wu F.C.W. Analysis of the relationship between defective sperm function and the generation of reactive oxygen species in cases of oligospermia. J Androl 1989; 10: 214.
4. Ahmadi A., Ng S.-C. Fertilising ability of DNA-damaged sperm. J Exp Zool 1999; 284: 696-704.
5. Aynaud O., Poveda J.-D. Frequence of herpes simplex virus, cytomegalovirus and human papillomavirus DNA in semen. J Androl 2001; Suppl (Abstr): 1: 2-141.
6. Boulton V.N., Braude P.R. Preparation of human spermatozoa for in vitro fertilisation by isopycnic centrifugation of self-generating density gradients. Arch Androl 1984; 13: 176-176.
7. Cassuto N.G., Sifer C., Naouri M., Bouret D., Blanc-Layrac G., Benifla J.L., Neuraz A., Alvarez S., Madelenat P., Feldmann G., Devaux A. Screening of hepatitis C virus (HCV) in the different fractions of semen from infected infertile men. Hum Reprod 2001; 16: (Аbstr): 139.
8. Chan P.J., Su B.C., Kalugdan T., Seraj I.M., Tredway D.R., King A. Human papilloma virus gene sequences in washed human sperm deoxyribonucleic acid. Fertil Steril 1994; 61: 982-985.
9. Diemer T., Weidner W., Michelmann H.W. Influence of Escherichia coli on motility parameters of human spermatozoa in vitro. Int J Androl 1996; 19: 271-277.
10. Dozortsev D., Rybouchkin A., De Sutter P., Dhont M. Sperm Plasma membrane damage prior to intracytoplasmic sperm injection: a necessary condition for sperm nucleus decondensation. Hum Reprod 1995; 10: 2960-2964.
11. El-Mulla K.F., Kцhn F.M., Dandal M. In vitro effect of Escherichia coli on human sperm acrosome reaction. Arch Androl 1996; 37: 73-78.
12. Evenson D.P., Larson K.L., Jost L.K. The sperm chromatin structure assay (SCSA™): clinical use for detecting sperm DNA fragmentation related to male infertility and comparisons with other techniques. J Androl 2002; 23: (in press).
14. Friberg J., Fullan N. Attachment of Escherichia coli to human spermatozoa. Am J Obstet Gynecol 1983; 146: 465-467.
15. Fridstrцm M., Matilainen E., Hovatta O., Lindgren S., Bohlin A.-B., Pehrson P.O., Albert J. Is it possible to reduce the amount of HIV virus in semen. Proc. XIII Nordic IVF Congress. 2000; 34.
16. Guibert J., Merlet F., Le Dы A., Leruez M., Heard I., Costagliola D., Mandelbrot L., Kunstmann J.M., De Almeida M., Salmon D., Sicard D., Zorn J.R., Rouzioux C., Jouannet P. ICSI for HIV1 serodifferent couples: results of a preliminary study. Hum Reprod 2001; 16: (Abstr): 140.
17. Hlinka D., Herman M., Vesela J., Hredzak R., Horvath S., Pacin J. A modified method of intracytoplasmic sperm injection without the use of polyvinylpyrrolidone. Hum Reprod 1998; 13: 1922-1927.
18. Jean M., Miralliй S., Boudineau M., Tatin C., Barriиre P. Intracytoplasmic sperm injection with polyvinylpyrrolidone: a potential risk. Fertil Steril 2001; 76: 419-420.
19. Kaur M., Tripathi K.K., Bansal M.R. et al. Bacteriology of the cervix in cases of infertility: effect on human sperm. Am J Reprod Immunol Microbiol 1986; 12: 21-24.
20. Kuzan F.B., Hillier S.L., Zarutskie P.W. Comparison of three wash techniques for the removal of micro-organisms from semen. Obstet Gynecol 1987; 70: 836-839.
21. Levy R., Bourlet T., Garcia A., Cordonier H., Salle B., Lornage J., Pozzetto B., Guerin J.F. Assisted reproductive techniques (ART) in hepatitis C virus (HCV)-infected male patients: preliminary results. Hum Reprod 2001; 16: (Abstr): 141.
22. Lyerly A.D., Anderson J. Human immunodeficiency virus and assisted reproduction: reconsidering evidence, reframing ethics. Fertil Steril 2001; 75: 843-858.
23. Marina S., Marina F., Alcolea R., Nadal J., Exposito R., Huguet J. Pregnancy following intracytoplasmic sperm injection from an HIV-1-seropositive man. Hum Reprod 1998; 13: 3247-3249.
24. Marina F., Alcolea R., Exposito R., Martin P., Fosas N., Perez N., Marina S. Special semen-washing technique as a safe method for using assisted-reproduction techniques in HIV-1 seropositive men. Hum Reprod 1998; 15:(Abstr P-145): 155-156.
25. Meng-Yin Tsai, Fu-Jen Huang, Fu-Tsai Kung, Yi-Chi Lin, Shiuh-Young Chang, Jick-Fuu Wu, Hsueh-Wen Chang. Influence of Polyvinylpyrrolidone on the outcome of intracytoplasmic sperm injection. J Reprod Med 2000; 45: 115-120.
26. Morrell J.M., Sakkas D., Moffatt O., Manicardi G.C., Bizzaro D., Holmes P.V. Reduced senescence and retained chromatin integrity in human sperm prepared by density gradient centrifugation. J Androl 2001; Suppl (Abstr P5/6): 34.
27. Mortimer D. Practical Laboratory Andrology. Oxford University Press 1994.
28. Mortimer D. Sperm Preparation Methods. J Androl 2000; 21: 357-366.
29. Neftel K.A., Muller M.R., Walti M. Penicillin-G degradation products inhibit in vitro granulopoiesis. Br J Haematol 1983; 54: 255-260.
30. Nicholson C.M., Abramsson L., Holm S.E., Bjurulf E. Bacterial contamination and sperm recovery after semen preparation by density gradient centrifugation using silane-coated silica particles at different g forces. Hum Reprod 2000; 15: 662-666.
31. Pasquier C., Daudin M., Righi L., Berges L., Thauvin L., Berrebi A., Massip P., Puel J., Bujan L., Izopet J. Sperm washing and virus nucleic acid detection to reduce HIV and hepatitis C virus transmission in serodiscordant couples wishing to have children. AIDS 2000; 14: 2093-2099.
32. Prakash P., Leykin L., Chen Z., Toth T., Sergegh R., Schiff I., Isaacson K. Preparation by differential gradient centrifugation is better than swim-up in selecting sperm with normal morphology (strict criteria). Fertil Steril 1998; 69: 722-726.
33. Ranganathan P., Agarwal A. Recovery and survival of sperm is higher after preparation with PureSperm density gradients than with swim-up in cryopreserved-thawed semen specimens. Fertil Steril 2001; 76: Suppl P-311.
34. Sakkas D., Manicardi G.C., Tomlinson M., Mandrioli M., Bizzaro D., Bianchi P.C., Bianchi U. The use of two density gradient centrifugation techniques and the swim-up method to separate spermatozoa with chromatin and nuclear DNA anomalies. Hum Reprod 2000; 15: 1112-1116.
35. Salisbury G.W., VanDemark N.L., Lodge J.R. Physiology of Reproduction and Artificial Insemination in Cattle. 2 edn, W.H. Freeman. San Fransisco 1978.
36. Sцderlund B., Lundin K. The use of silane-coated silica particles for density gradient centrifugation in in-vitro fertilization. Hum Reprod 2000; 15: 857-860.
37. Strehler E., Baccetti B., Sterzik K., Capitani S., Collodel G., De Santo M. Detrimental effects of polyvinylpyrrolidone on the ultrastructure of spermatozoa (Notulae seminologicae 13). Hum Reprod 1998; 13: 120-123.
38. Tomlinson M.J., Moffat O., Manicardi G.C., Bizzaro D., Sakkas D. Sperm morphology and nuclear DNA integrity after density gradient centrifugation (DGC) through PureSperm: relationship to IVF outcome. J Androl 2001; Suppl (Abstr P3/4): 100.
39. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction 1999; 4th edn. Cambridge University Press 1999.
40. Wolff H., Panhans A., Stolz W., Meurer M. Adherence of Escherichia coli to sperm: a mannose mediated phenomenon leading to agglutination of sperm and E. coli. Fertil Steril 1993; 60: 154-158.