Окраска препарата
ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ И МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
(Микроскопическая техника: Руководство / Под редакцией Д.С.Саркисова и Ю.Л.Перова. — М.: Медицина, 1996. ISBN 5-225-02-820-9).
В основе окрашивания клеток и тканей лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах. Большое значение имеют плотность ткани и дисперсность красителя, которые определяют последовательность и скорость окрашивания.
Целью окрашивания является более отчетливое выявление различных компонентов клеток и тканей.Некоторые красители обеспечивают этот эффект, растворяясь в выявляемых компонентах, например нейтральных жирах. Другие красители вызывают химическую реакцию, например выявление железа с образованием берлинской лазури в кислой среде. Во многих случаях процесс окрашивания возможен только при наличии протравы, например гематоксилин окрашивает ткань в присутствии солей металлов.
В гистологической практике применяют основные, кислотные и нейтральные красители.
Основные, или ядерные, красители — это основания или их соли, которые окрашивают структуры кислой природы (хроматин ядер, ядрышко и др.) и называются базофильными (гематоксилин, тионин, кармин, метиловый зеленый и др.).
Кислотные красители — это кислоты или их соли, с помощью которых выявляют вещества и структуры основной природы (цитоплазматические структуры клеток, эритроциты и т.д.). Таковыми являются эозин, кислый фуксин, конго красный (конгорот), эритрозин.
Нейтральные красители: судан III, судан IV, метиленовый синий.
Процесс гистологического окрашивания условно подразделяют на прогрессивный и регрессивный, прямой и непрямой, простой и сложный. При прогрессивном типе окрашивания процесс идет до тех пор, пока не достигается интенсивное проникновение красителя в ткань. Регрессивный тип основан на первоначальном перекрашивании структур с последующей дифференцировкой до нужного уровня. Если раствор красителя непосредственно действует на ткань, то говорят о прямом окрашивании. Окрашивание после предварительной подготовки ткани (протравливания) называется непрямым. Окрашивание одним красителем — простое, а при использовании нескольких красителей — сложное.
ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ПОДГОТОВКА СРЕЗОВ К ОКРАШИВАНИЮ
Депарафинирование срезов
Парафиновые или целлоидин-парафиновые срезы перед окрашиванием освобождают от парафина с помощью любого его растворителя — бензола, толуола, ксилола, бензина. Особенно тщательно удаляют парафин перед исследованием ткани в поляризационном микроскопе, так как парафин обладает двоякопреломляющим свойством. Депарафинирование осуществляют по следующей схеме,
| Ксилол I | 10-15 мин (можно в термостате при 37 °С) |
| Ксилол II | 3 — 5 мин |
| Спирт 100 % I | 1-2 мин |
| Спирт 100 % II | ополоснуть |
| Спирт 96 % I | оплоснуть |
| Спирт 96% II | ополоснуть |
| Дистиллированная вода | 2 смены |
После депарафинирования 100-150 препаратов реактивы нужно менять. Депарафинированные препараты готовы к окрашиванию сразу же после промывания в дистиллированной воде, но во избежание отклеивания срезов, особенно при окраске по Ван-Гизону, их лучше подсушить на воздухе. Если окрашивание производят не сразу, то депарафинированные и высушенные препараты аккуратно, чтобы не повредить срезы, складывают в коробки и окрашивают по мере необходимости.
ЗАМЕЧАНИЯ ПО ТЕХНИКЕ ОКРАШИВАНИЯ
При окраске водными красителями срезы переносят в краситель из дистиллированной воды, а при окраске спиртовыми — из соответствующего раствора спирта. После того как препарат приобретает интенсивную окраску, его промывают в воде или спирте для удаления избытка красителя (дифференцировка), контролируя этот процесс под микроскопом.
Срезы тканей после целлоидиновой и парафиновой заливки, а также полученные на замораживающем микротоме окрашивают в широкогорлых бюксах или на часовых стеклах. Одновременно окрашивают несколько срезов, но промывают, дифференцируют и т.д. каждый срез отдельно.
Препараты можно помещать в красящий раствор в специальных контейнерах, предназначенных для одновременного окрашивания большого количества стекол. Если препаратов немного, то рациональнее краситель наносить непосредственно на срез по каплям с помощью пипетки. Остатки красителя можно слить в склянку и использовать повторно. Д. Кисели (1962) предлагал накрывать при этом срезы стеклянным колпаком, а для увлажнения среды оставлять под колпаком смоченную водой вату.
ПРОСВЕТЛЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ СРЕЗОВ
Одним из основных условий, определяющих пригодность гистологических препаратов к микроскопическому исследованию, является их прозрачность. Кроме того, препараты должны быть защищены от высыхания и загрязнения. Все это обеспечивается просветлением и заключением в специальные среды, которые можно подразделить на смешивающиеся с водой (глицерин, гуммиарабик, поливиниловый спирт, желатин) и не смешивающиеся с водой (ксилол, толуол, их смеси с фенолом, эфирные масла).
Смешивающиеся с водой просветляющие вещества одновременно являются средой для заключения и приготовления постоянных препаратов.
Заключение в среды, смешивающиеся с водой
Из этих сред чаще применяют глицерин-желатин. Используют также чистый глицерин, однако этот метод не позволяет приготовлять постоянные препараты.
Р. Лилли рекомендует для этих целей гумми-сироп Апати:
чистый гуммиарабик 50 г
дистиллированная вода 50мл
Смесь растворяют на водяной бане при постоянном помешивании, затем добавляют 500 мг тимола. Используют также поливиниловый спирт.
Среды, смешивающиеся с водой (кроме глицерина), предварительно нагревают на водяной бане, капают нагретой стеклянной палочкой или пипеткой на расправленный срез, слегка подсушивают и покрывают чистым и сухим покровным стеклом. Чистой стеклянной палочкой или обезжиренным пальцем слегка прижимают покровное стекло. При этом излишки среды выдавливаются и их аккуратно удаляют чистой тканью.
Для длительного хранения препаратов, чтобы избежать их высыхания, многие авторы рекомендуют окантовывать покровное стекло тонким слоем парафина или целлоидина. Однако опыт показывает, что заключенные в глицерин-желатин препараты и без окантовки хорошо сохраняются свыше 10 лет.
Просветление препаратов и заключение в среды,
не смешивающиеся с водой
Срезы или наклеенные на стекло препараты тщательно обезвоживают в спиртах (70 %, 96 % и 100 %), а затем помещают в любые из просветляющих веществ. Установлено, что для разных исследований предпочтительнее то или иное просветляющее вещество. Так, при окраске по Нисслю и методу Грама — Вейгерта лучшим просветляющим и одновременно дифференцирующим средством является анилиновое масло, но для просветления препаратов при окраске по Ван-Гизону использование его недопустимо. Наиболее распространенными и индифферентными по отношению к красителям веществами являются толуол и ксилол, а также их смеси с фенолом (кристаллический фенол расплавляют в термостате при 56 °С и смешивают с ксилолом в пропорции 1:4 или 1:6).
Хорошо обезвоженные в спиртах и просветленные в карбол-ксилоле, а затем в чистом ксилоле препараты готовы к заключению в специальные смолы. С этой целью применяют смолы растительного происхождения — бальзамы (канадский, пихтовый и сибирский кедровый). Все они хорошо растворяются в толуоле и ксилоле.
Метод растворения: в склянку с сухой смолой заливают толуол, который постепенно растворяет верхние слои смолы. Процесс можно ускорить, если склянку поместить в термостат при 37 — 40 «С. Полученный густой раствор сливают в другую банку и добавляют новую порцию толуола, одновременно перемешивая раствор и доводя до консистенции жидкого меда. Слишком жидкий раствор по мере испарения толуола вновь загустевает. Приготовленный бальзам хранят в плотно, закрытой посуде.
В практической патоморфологии широко используют синтетическую пластмассу — полистирол. Способ применения этого пластического материала предложен Д.С. Саркисовым и подробно изложен в руководстве Г.А.Меркулова «Курс патологогистологической техники» (1969). Полистирол хорошо растворяется в ксилоле и толуоле, прозрачен и быстро затвердевает под предметным стеклом, образуя тончайшую пленку. Метод растворения тот же, что и для смол растительного происхождения. Однако со временем полистирол становится хрупким, в пленке появляются трещины, что затрудняет микроскопическое исследование и совершенно неприемлемо для микросъемки. Для предотвращения этих недостатков в 30 % раствор полистирола в ксилоле добавляют пластификатор, придающий пленке эластичность и гибкость, устраняя все недостатки полистирола. В настоящее время в качестве пластификатора используют дибутилфталат, широко применяемый в электронной микроскопии. Существует несколько вариантов приготовления полистирола для заключения препаратов:
1) 94 мл 30 % раствора полистирола в ксилоле смешивают с 6 мл дибутилфталата;
2) смесь, состоящую из 100 г полистирола, 100 мл ксилола и 12 мл дибутилфталата, растворяют при 22 °С или в термостате при 37 °С, периодически перемешивая.
Готовую синтетическую смолу хранят в плотно закрытой посуде. Технология заключения срезов та же, что и при применении водорастворимых сред.
ЯДЕРНЫЕ КРАСИТЕЛИ И ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЕ
Окрашивание ядер клеток обусловлено двумя механизмами химического взаимодействия: 1) основные красители, например анилиновые, образуют соли в присутствии ДНК и РНК; 2) образуются комплексы с ионами металлов при применении протравы. В практической работе чаще используют протравные красители. К ним относятся гематоксилин, кармин, сафранин, галлоцианин, ализарин. Хорошо окрашивают ядра такие красители, как янус зеленый, основной коричневый, оксазиновые красители (крезиловый фиолетовый, нильский голубой), тианин, азуры, метиленовый синий, основной фуксин, метиловый зеленый и др. Следует упомянуть о хороших результатах окраски ядер соком черники, которая предложена М.Д. Лавдовским еще в 1887 г.
Гематоксилин и способы его приготовления
Гематоксилин имеет растительное происхождение: его получают из эфирного экстракта кампешевого дерева. Гематоксилин хорошо растворяется в спирте и плохо в воде. Красящими свойствами обладает продукт окисления гематоксилина — гематеин, поэтому краситель становится пригодным только после созревания — окисления, на которое требуется от 10 дней до 2 — 3 нед. Созревание можно ускорить с помощью солей алюминия, хрома, железа и др.
Гематоксилин Эрлиха
Гематоксилин кристаллический 2гр
Дистиллированная вода 100мл
Алюмокалиевые или алюмоаммонийные квасцы 3г
Ледяная уксусная кислота 10мл
Гематоксилин растворяют в спирте, а квасцы — в дистиллированной воде, смешивают оба раствора и затем добавляют остальные компоненты. Раствор периодически перемешивают. Через 10-14 дней он приобретает темно-вишневый цвет, что свидетельствует о готовности красителя. Продолжительность окрашивания гематоксилином Эрлиха 4 — 6 мин. Затем следуют Промывание в дистиллированной, потом в водопроводной воде, Дифференцировка в 1 % солянокислом спирте, восстановление в аммиачной воде и окончательное промывание в дистиллированной воде.
Для приготовления солянокислого спирта к 100 мл 70 % спирта добавляют 1 мл концентрированной соляной кислоты; для приготовления аммиачной воды к 50 мл дистиллированной воды добавляют 2 капли крепкого аммиака.
Нейтральные красители в гистологии что окрашивают
В гистологии, цитологии и эмбриологии существует много методов исследования.
1.1. Световая микроскопия
1.1.1. Устройство микроскопа
оптическая,
1. Оптическая система включает объектив и окуляр.
Обычные увеличения объектива:
90 (иммерсионный объектив).
Полный размер
б) Окуляр (3) вставляется в тубус сверху. Применяются окуляры с увеличением
7, 10, 15.
20 10 = 200 раз.
б) Зеркало (5) собирает лучи от источника и направляет их на препарат снизу.
в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей.
г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с отверстием посередине.
Они поднимают и опускают тубус для фокусировки изображения объекта на сетчатке глаза наблюдателя.
б) Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости, что позволяет менять участки препарата, попадающие в поле зрения.
1.1.2. Приготовление гистологического препарата
1. По характеру взятого материала различают следующие виды гистологических препаратов:
Чаще всего используются срезы. 2. Приготовление препарата обычно включает 4 следующих этапа:
1.1.2.1. Взятие и фиксация материала 3. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов. |
1.1.2.2. Обезвоживание и уплотнение материала
2. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань).
б) Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле.
3. Заливка : помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин
1.1.2.3. Приготовление срезов
2. а) С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (напр., 10 мкм).
1.1.2.4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду
(Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.)
2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами
4. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или
кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.
1.1.2.5. Мазки и тотальные препараты: особенности приготовления
1.1.3. Методы окрашивания гистологических препаратов
1.1.3.1. Типы красителей
Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа.-
| Тип красителя | Пример | Окрашиваемые структуры |
| Кислоты и кислые соли : б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна). | ||
| Основные с оли : Нейтральные красители | Смесь двух красителей: б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2. | |
1. Препарат
2. Структуры приобретают коричневато-серый цвет. 3. Хорошо выявляются
1.1.3.3. Выявление неклеточных структур соединительной ткани 1. Окраска по методу ван Гизона | Базофильные элементы окрашиваются азуром 2 в тёмно-синий, б) Отличия же от приготовления срезов таковы:
2. |
1.1.3.5. Выявление элементов нервной системы
1.Импрегна-
ция
нитратом
серебра
Срез готовят на специальном замораживающем микротоме.
2. При окрашивании срез последовательно обрабатывают растворами
2. Окраска
толуидино-
вым синим по методу Ниссля
2. С его помощью в цитоплазме нервных клеток обнаруживаются глыбки базофильного вещества (т.н. субстанция Ниссля).
2. а) Как и предыдущий метод, относится к гистохимическим методам исследования.
б) Поэтому подробней описывается ниже.
1.1.4. Гистохимические методы исследования
а) Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата.
б) Образующийся продукт реакции имеет окраску, отличную от окраски исходного реактива.
1а) РНК
3. Обычно делают и контрольный препарат, который перед окрашиванием обрабатывают рибонуклеазой.
1б) ДНК
2. Белки
3а)
Полисахариды
2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, которая взаимодействует с реактивом Шиффа.
3б)
Гликозамин-
гликаны
1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия
— изменение окраски с синей на фиолетовую и красную.
(являющиеся, как известно, гетерополисахаридами с высоким содержанием кислотных радикалов).
4. Нейтральный
жир
Капли жира в жировой клетке окрашиваются в яркий оранжево-красный цвет благодаря растворению в них красителя.
1.1.5. Просмотр препаратов
1.1.5.1. Срез; окраска гематоксилин-эозином
1. На снимке мы видим внутреннюю поверхность тонкой кишки с находящимися на ней кишечными ворсинками ( 1).
б) Цитоплазма (3) оксифильна и окрашена эозином в розовый цвет.
1. а) Препарат является тотальным.
1.1.5.3. Срез после декальцинации; окраска по Шморлю
| 3. Препарат — пластинчатая костная ткань. Поперечный срез трубчатой кости. Окраска по методу Шморля. 1. В процессе изготовления препарата костный материал подвергнут декальцинации (п. 1.1.3.3). 1.1.5.4. Срез; окраска по Маллори 1. В методе Маллори используются 3 красителя (п. 11.3.3), что делает картину многоцветной.
1.2. Электронная микроскопия 1.2.1. Принцип работы электронного микроскопа 1.2.1.1. Особенности: 2. Конструктивная же особенность состоит в том, что в электронном микроскопе в качестве линз используются электромагнитные катушки. | Внешний вид электронного микроскопа 1.2.1.2. Ход лучей
|
